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Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 3625 (2023) Citar este artigo

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A pesquisa baseada em biochip está atualmente evoluindo para uma base tridimensional e em larga escala semelhante ao microambiente in vivo. Para imagens vivas e de alta resolução de longo prazo nesses espécimes, a microscopia não linear capaz de imagens multiescala e sem etiquetas está se tornando cada vez mais importante. A combinação com imagem de contraste não destrutivo será útil para localizar com eficácia as regiões de interesse (ROI) em amostras grandes e, consequentemente, minimizar o fotodano. Neste estudo, uma microscopia de coerência óptica fototérmica sem rótulo (OCM) serve como uma nova abordagem para localizar o ROI desejado em amostras biológicas que estão sob investigação por microscopia multifotônica (MPM). A perturbação fototérmica fraca na amostra pelo laser MPM com potência reduzida foi detectada nas partículas fototérmicas endógenas dentro do ROI usando o OCM fototérmico diferenciado de fase altamente sensível (PD-PT). Ao monitorar a mudança temporal do sinal de resposta fototérmica do PD-PT OCM, o ponto de acesso gerado dentro da amostra focalizada pelo laser MPM foi localizado no ROI. Combinado com o movimento automatizado da amostra no eixo x–y, o plano focal do MPM pode ser efetivamente navegado para a porção desejada de uma amostra volumétrica para imagens MPM direcionadas de alta resolução. Demonstramos a viabilidade do método proposto em microscopia de geração de segundo harmônico usando duas amostras fantasmas e uma amostra biológica, um inseto fixado em lâmina de microscópio, com dimensões de 4 mm de largura, 4 mm de comprimento e 1 mm de espessura.

A microscopia multifotônica (MPM) permite análises de alta resolução em vários campos de pesquisa biológica. Nos últimos anos, o uso de MPM continuou a ganhar atração em imagens biomédicas, especialmente em áreas de imagens in vivo e de neurônios profundos vivos em pequenos animais1,2,3,4,5, detecção precoce de tumores e sua caracterização6,7, 8,9, rede vascular e imagens de organoides em seu microambiente em biochips10,11,12. Tem havido muitas abordagens para aumentar a profundidade da imagem, maior campo de visão (FOV) e encurtar o tempo de varredura volumétrica adotando fluoróforos apropriados13, óptica adaptativa14, multifeixe e mecanismos multifocais15,16, além de outras modificações semelhantes na configuração óptica que deu variações de sistemas de imagem MPM adotáveis ​​de acordo com as necessidades de imagem e cenários de aplicação 5,16,17,18,19,20,21.

O fotodano e o fotobranqueamento são fatores críticos a serem considerados na geração de imagens multifotônicas. Iluminação prolongada acompanhada de alta potência do laser necessária para geração de imagens multifótons sem etiqueta, há fotomecanismo de dano tecidual que resulta em fluorescência aumentada causando morte celular, que é amplamente conhecida como fotodano 22,23,24. Para evitar a ocorrência de fotodano em células vivas, deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros de imagem estejam bem abaixo do limiar de fotodano, como pico de intensidade, taxa de repetição e tempos de exposição prolongada (permanência)24. A maioria desses parâmetros pode ser controlada pelos sistemas de origem e detecção. Vários grupos de pesquisa estudaram e propuseram várias abordagens para suprimir os efeitos do fotobranqueamento e fotodano. O método mais simples e amplamente adotado é reduzir o poder de iluminação total de uma fonte de luz4,25,26. No entanto, isso, por sua vez, reduz a sensibilidade geral do sistema devido à redução da relação sinal-ruído. Abordagens alternativas relatadas para mitigar esse efeito envolvem um método de exposição controlada à luz que controla espacialmente a luz exposta na amostra, o uso de um divisor de pulso passivo que redistribui o pulso de laser de iluminação em subpulsos com energias iguais e uma varredura óptica rápida mecanismo que reduz fotodanos controlando a iluminação e coleta de emissão de espécimes27,28,29,30. Além disso, usando o método de iluminação light-sheet, apenas o plano focal da objetiva de detecção é efetivamente iluminado31. Embora esses métodos sejam úteis para reduzir os efeitos do fotodano e do fotobranqueamento, a iluminação de alta potência e longo prazo é necessária ao procurar a região de interesse (ROI) em grandes amostras com pequenos FOVs e longos tempos de varredura volumétrica, resultando em fotodano e fotobranqueamento.